细胞冻存与复苏是一种用于长期储存细胞的技术。在这个过程中，细胞被置于低温环境中，减缓其代谢活动。通过将细胞冷冻保存在液氮中（通常为-196℃），细胞暂时脱离生长状态，但其细胞特性得以保存。当需要时，可以通过复苏将这些冻存的细胞重新激活，以供实验使用。这种方法能够适度地保存一定数量的细胞，防止细胞受到污染或其他意外事件的影响，从而发挥了细胞保种的作用。
本文将为大家介绍细胞冻存与复苏的技术要点和操作步骤。
细胞冻存原理
当细胞降温至零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，以防止细胞内形成大冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
低温保护剂的应用原理
1、在细胞冻存时加入低温保护剂，增加细胞渗透压稳定性，减缓慢速降温过程中的脱水皱缩现象，能大大提高冻存效率；
2、常用的低温保护剂是DMSO（二甲基亚砜），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
细胞冻存方法
方法一：使用程序冻存盒
步骤1：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷
步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）
步骤3：用配制好的冻存液重悬细胞，按照1~1.5mL/管分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记
步骤4：冻存管放入冻存盒，冻存盒放入-80℃冰箱过夜（24h）
步骤5：冻存管从冻存盒取出，转移至液氮长期保存
▲ 使用冻存盒操作示意图
方法二：使用无血清非程序冻存液
步骤1：从冰箱拿出无血清非程序冻存液，待用
步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）
步骤3：弃上清，加入适量无血清非程序冻存液，重悬细胞
步骤4：按照1~1.5mL/管的量分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记
步骤5：将冻存管直接移入-80℃冰箱中，24h后转移至液氮长期保存
▲ 使用无血清非程序冻存液操作示意图
方法三：手动梯度降温
步骤1：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷
步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）
步骤3：用配制好的冻存液重悬细胞，按照1~1.5mL/管分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记
步骤4：冻存管按照【4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（24h）→液氮】的顺序放置
▲ 手动梯度降温操作示意图
细胞复苏原理
复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。
细胞一般采用快速融化以避免慢速融化水分渗入细胞内再次形成胞内结晶损伤细胞。
细胞复苏方法
步骤1： 取出冻存管，从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动，促使其尽快融化。
步骤2：处理细胞悬液，从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，将其加入离心管中，并滴加10倍以上的培养液，然后混匀。
步骤3：离心，进行1,000 rpm，5分钟的离心。
步骤4：调整细胞密度，弃去上清液，加入含10%小牛血清的培养液以重悬细胞。进行计数，调整细胞密度后，将其接种到培养瓶中，并置于37℃培养箱中，静置培养。
步骤5：继续培养，次日更换一次培养液，继续进行培养。
细胞冻存、复苏注意事项
1. 确保细胞状态良好：在冻存之前，确保细胞具有良好的形态，并且没有污染。
2. 选择适合的冻存液：根据细胞类型选择合适的冻存液，并按照相应的操作规程进行细胞的冻存。
3. 控制细胞密度：要控制好细胞的密度，避免过低或过高影响冻存效果。不同的冻存液针对不同细胞有适当的冻存密度范围，以确保细胞在冷冻和复苏过程中的存活率。
4.尽快冷冻：细胞悬液加入冻存液后尽量短时间在常温放置，因为常温下DMSO对细胞会造成损伤。建议尽快通过程序降温或一步法等方式进行细胞的冷冻保存。
5. 合理存放：细胞长期存放在-80℃冰箱时，建议靠冰箱内侧放置样本，避免开关冰箱导致温度不稳定影响细胞保存效果。
6. 检测存活率：细胞冻存后应取出一管进行复苏，并检测细胞的存活率。为稳妥起见，可在细胞冻存半年后进行复苏培养，并观察细胞生长情况后继续冻存。
7. 温和解冻：使用适当的方法解冻细胞，如将冻存管放入37°C的水浴中直至完全解冻。避免使用高温或暴露时间过长的方法，以减少DMSO对细胞的毒性作用。
8. 匀速摇晃：细胞融解过程应匀速、均一地摇晃以加速融解，同时避免流体剪切力对细胞的损伤。
9.尽快去除DMSO：已融解的冻存细胞应尽快在常温下存放，并尽快离心去除DMSO。
