在生物样本库和细胞治疗行业中，基于气相液氮（LN2）的存储系统储存样本十分常见。这类液氮罐能够提供低于-150℃的储存环境，从而将样本保持在-135℃以下，即水的玻璃化转变温度（Tg）。这种低温储存方法保持了样本的活性。

在常规冻存架暴露过程中，无关样本（不需要解冻的样本）可能会受到影响。数以千计的无关样本在整个储存期间可能会多次暴露，在玻璃化转变阶段持续解冻/冷冻可能会造成不可逆的损坏，并在解冻时影响样本功能。 

本篇文章我们通过手动和自动系统处理无关样本所展现的工作流程、时间和升温速率作出了方案对比。使用手动LN2液氮罐过程中，通过从液氮罐取出（拉出）冻存架对标准冻存架中五个不同搁板位置的样本（水）进行监控。以及使用AI智能生命数据库M9，使用相同设置和位置重复该实验。

生物样本手动存储

生物样本自动化存储

|材料

1、AI智能生命数据库M9；

2、LN2-196℃蒸汽液氮罐（ARD），带冻存架；

3、5个10 x10带盖冻存盒；

4、5个 2mL冻存管，放置在每个冻存盒的中心位置；

5、所有冻存管装满2mL水；

6、36 AWG T型热电偶安装在水位中间；

7、测量计算TC-Temp数据采集设备，使用TracerDAQ软件以1.0hz。

|方法

1、2mL冻存管装满2mL水并安装细线热电偶；

2、将冻存管放入冻存盒中心位置，盖上盖子，然后将冻存盒分别插入冻存架的搁板1（顶层）、搁板4、搁板7、搁板10和搁板13中；

3、监控冻存管，直到顶部冻存盒内样本温度达到-180℃±2℃；

4、使用AI智能生命数据库M9取出冻存架10次；

5、手动取出冻存架并移到液氮罐一侧10次；

6、使用AI智能生命数据库M9取出冻存架并分别放至搁板1、3、5、7和14上5次；

7、不移除、处理或触摸冻存盒。

|结果

|与常规工作流程的对比

手动LN2液氮罐中取出样本的工作流程可能因实验室、用户甚至日常情况而异。由于整个过程手动完成，因此不会自动监控和记录无关样本暴露、取出时间和库存。

手动LN2液氮罐中取出冻存盒的标准步骤：

1. 走上脚梯

2. 取下盖子

3. 向内伸手转动转盘，找到所需的冻存架

4. 将冻存架向上提起并取出

5. 把冻存架放在液氮罐上，或者走下来放在工作台上或底板上

6. 打开冻存架固定卡扣

7. 找到并移除所需的冻存盒

8. 锁定冻存架固定卡扣

9. 将冻存架提起，然后放回液氮罐

10. 盖上盖子

11. 走下脚梯

从AI智能生命数据库M9中取出冻存盒的标准步骤：

1. 将样本编号或位置输入电脑并提交

2. 出现提示（冻存架升高）时，打开门并移动冻存盒

3. 冻存架会自动收回到液氮罐

|用时对比

使用手动液氮罐，每个冻存盒的取出可能需要不同的时间，这取决于其在液氮罐中的位置以及操作者的速度和准确性。以下是估计时间：

• 2分钟：找到并取出冻存盒的时间

• 30秒到2分钟：冻存架暴露在LN2液氮罐外的时间

使用AI智能生命数据库M9取回冻存盒，工作流程标准化并通过自动化进行控制。用时会因箱子的位置而异，但冻存架的暴露是可控的。

• 30到90秒：找到并取出液氮罐的时间

• 15到30秒：冻存架暴露在LN2液氮罐外的时间

随着自动化的使用，人工劳动大大减少。此外，所有行动和样本暴露都受到控制、监测和记录。

|样本升温速率

在手动工作流程中，冻存架在液氮罐外的时间一般超过30秒。使用自动化流程，可以减少冻存架的暴露时间，并且在冻存架周围增加隔热层，也可以减少样本的升温。但为了进行同等比较，下图显示了手动和自动冻存架拉出过程中，每个无关样本在环境暴露的前30秒升温速率。

对比平均所有搁板的样本升温速率，M9在暴露的前30秒升温速率比手动流程慢70%。搁板1中的升温速率最高，尽管M9对于较低搁板具有相对线性的升温速率，但手动冻存架在不同搁板之间具有显著的差异。

注：手动冻存架升温会受到环境的进一步影响。搁板13（可能还有搁板14）受到冻存架所在表面的影响，我们发现隔热泡沫提供了最低的热传递。标准空调通风口的室内气流也会影响手动冻存架升温约30%。

|隔板位置

下面显示了每个搁板从取出到-120℃（超过玻璃化转变温度）的升温速率以及达到-120℃的平均时间。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，以防止细胞内形成大冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

|样本温度

以下是使用手动和M9工作流程暴露2分钟期间所有5个无关样本的温度。

下图显示了使用M9系统从搁板1（顶部）和搁板7取回冻存盒时所有5个无关样本的温度。请注意，与从LN2液氮罐中取出整个冻存架相比，下层搁板样本的温度要低得多。为保护无关样本升温，最好仅将冻存架提升至取出所需冻存盒所需的最小高度。

|结论

· 与手动操作相比，使用AI智能生命数据库M9时，取出冻存盒的工作流程步骤大大简化；

· 在冻存架取出后的前30秒，AI智能生命数据库M9的样本升温速率比手动低70%；

· 与手动相比，使用M9存储系统无关样本的Tg升温时间要长51%；

· 与手动相比，使用M9存储系统可实现人员低温“0”接触，一键全自动挑选样本，降低人为操作出错率及交叉污染；

· 与手动相比，使用M9存储系统可实现一人一码可溯源可追踪，支持整存零取/零存整取等操作场景；

· 与手动相比，使用M9存储系统可与AMR机器人、深低温自动化存储系统无缝对接，实现全库区无人值守样本库管理；

· 如果手动取出冻存架，需要彻底了解升温速率、环境变量和影响因素。制定SOP并定期审核，以确保高价值样本始终安全保持在Tg以下；

· 将任一冻存架放回LN2液氮罐后，样本将继续升温，不同的样本体积将以不同的速率升温，即1mL冻存管的升温速度比2mL冻存管快约60%。

参考文献：

1 Warhurst, J., Fink, J., Holmes, T. et al. (2015 May).Protection of innocents: continued sample warm up after return to a cryogenic environment (below -150°C) following a transient ambient picking operation. Oral presentation presented at annual International

Society of Cellular Therapy conference, Las Vegas, NV.

2 Salvetti, M., Fink, J. Barlett, A. et al. (2015, May). Thermal excursions of cryogenically frozen vials (below -150°C) and the risk of rising above Tg,H2O: analyzing warm-up rates from cryogenic storage to both dry ice and ambient temperature environments.

Poster presented at annual International Society of Cellular Therapy conference, Las Vegas, NV.